流式细胞术是一项通过光电系统记录细胞的散射光信号和荧光信号，从而快速检测分析单细胞多物理特性的技术。流式细胞仪的主要原理是利用单细胞流经聚焦激光束时产生的荧光信号，快速捕捉并转化成电信号并进行信号处理，以达到异常细胞检出和分选的目的。流式细胞术广泛应用于基础生命科学领域和临床诊断，比如分析细胞表面和细胞内分子的表达、鉴定异质细胞群，同时通过多重标记进一步确定不同细胞亚群的比例；通过不同染料对细胞进行染色，从而判断细胞状态、功能水平、或者进行细胞周期分析等。

细胞周期

1.细胞收集与消化

贴壁细胞：收集培养上清，用胰酶消化细胞，消化至细胞可被吹打下来，加入预留上清，轻轻吹打使细胞脱落并分散，1000g离心3-5分钟，弃去上清，保留细胞沉淀。

悬浮细胞：直接收集细胞，1000g离心3-5分钟，弃去上清，保留细胞沉淀。

2.细胞重悬与洗涤：加入冰浴预冷的PBS（约1ml）重悬细胞，转至1.5ml离心管。再次离心沉淀细胞，小心弃去上清，保留少量PBS，轻弹离心管底，分散细胞，防止结团。

3.细胞固定：加入预冷70%乙醇（1ml），边加边涡旋混匀。4℃固定30分钟或更长，常规固定2小时以上更稳定，固定时间为12-24小时时染色效果更佳。

固定后离心（1000g，3-5分钟），弃去乙醇。用冰冷PBS洗涤一次，重悬细胞，再次离心，轻弹管底分散，备用。

4.染色液配制：根据样本数量按说明书配置染色液，一般每管样品需0.5ml染色液。染色液通常由染色缓冲液、PI染液和RNase A组成，需现配现用。

5.细胞染色：每管细胞加入0.5ml PI染色液，轻柔重悬，37℃避光孵育30分钟。

孵育后可置于冰浴或4℃避光保存待测。

6.流式细胞仪检测：用流式细胞仪检测荧光强度。

细胞凋亡

1.细胞收集

悬浮细胞：1000g离心5min，弃去上清。加入1ml预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，1000g离心5min，弃去上清，保留细胞沉淀。

贴壁细胞：小心吸取细胞培养液保存备用。加入PBS洗涤后，加入适量胰酶消化液消化细胞。加入前面收集的培养液，轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液，1000g离心5min，弃去上清。加入1ml预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，1000g离心5min，弃去上清，保留细胞沉淀。

2.细胞染色：加入195μl Binding Buffer，轻轻重悬细胞。加入Annexin V-FITC：加入5μl Annexin V-FITC，轻轻混匀。加入PI：加入10μl PI，轻轻混匀。室温下避光孵育10-20min，孵育过程中可轻轻颠倒数次以加强染色效果。

3.流式细胞仪检测：用流式细胞仪检测荧光强度。

活性氧检测

1.细胞准备：准备好足量细胞状态好的细胞进行分组处理等操作。

阳性对照（可选）：先用无血清培养基稀释阳性对照（如ROSUP，100mM）到常用工作浓度100μM，加入细胞，37℃避光孵育30min-4h以提高活性氧水平。

2.ROS探针准备：探针装载前，按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使其终浓度为10μM。

3.探针装载：除去细胞内药物，离心收集细胞，加入稀释好的探针，使其细胞密度为1.0×10⁶-2.0×10⁷，细胞在37℃培养箱中黑暗中孵育30min。

4.细胞清洗：用无血清细胞培养液洗涤细胞1-2次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。

5.流式细胞仪检测：用流式细胞仪检测荧光强度。

线粒体膜电位检测

1.细胞准备：准备好足量细胞状态好的细胞进行分组处理等操作。

阳性对照（可选）：试剂盒中提供的CCCP(10mM)推荐按照1:1000的比例加入到细胞培养液中，稀释至10µM，处理细胞20分钟。

2.JC-1染色工作液配制：取50μL JC-1(200×)加入8mLPBS稀释JC-1，再加入2mL JC-1染色缓冲液(5×)，混匀后即为JC-1染色工作液。

3.细胞染色：除去细胞内药物，离心收集细胞，加入1mL JC-1染色工作液，并充分混匀，细胞培养箱中37℃孵育20min，PBS洗涤一次细胞。

4.流式细胞仪检测：用流式细胞仪检测荧光强度。

细胞群体及亚群分析检测

1.准备单细胞悬液：组织/细胞制备成至少1×106/ml单细胞悬液

2.加入FC Block，封闭10 min，加入1ml DPBS洗涤（可选）

3.1ml DPBS 重悬细胞加入死活染料15min加入1ml DPBS洗涤（组织样本可选）

4.加入细胞表面染色抗体，室温孵育避光20min，加入1ml DPBS洗涤

5.加入固定破膜剂，室温孵育避光20min，加入1ml DPBS洗涤（胞内抗原检测可选）

6.在含有破膜剂的染色缓冲液中加入胞内染色抗体，室温孵育避光20min，加入1ml DPBS洗涤。（胞内抗原检测可选）

7.流式细胞仪检测：用流式细胞仪检测荧光强度。

多种细胞因子检测

1.试剂准备：将捕获微球涡旋混匀，使微球充分分散。根据实验需要，准备标准品、检测样本、检测抗体、洗液等试剂。

2.标曲制备：打开冻干标准品，加入适量的稀释液制备成一定浓度的标准品溶液，然后按照一定的梯度进行稀释，制备出一系列不同浓度的标准品。

3.捕获微球混合：根据实验所需的试管数量，将不同抗体包被的捕获微球混合在一起，涡旋混匀。

4.检测样本孵育：在每个实验试管中加入一定量的捕获微球，然后加入相应量的梯度稀释的标准品和检测样本，再加入检测抗体，混匀后室温下避光孵育一定时间。

5.上机检测：在每个试管中加入洗液，离心去除未结合的物质，小心吸掉上清，加入适量的洗液重悬微球，然后将微球悬液加入流式细胞仪中进行检测。

细胞分选

1.样本制备：根据实验需求准备带分选样本，若为细胞样本需保证细胞样本的纯度和活力。对于外周血样本，通常在采血后使用肝素做抗凝处理，并分离去除红细胞；对于实体组织样本，一般选择机械研磨或酶解法处理成单细胞悬液。收集和清洗细胞样本时，注意控制离心机的离心力在300×g以内，且不要使用过高的升速和降速。样本制备完成后，染色前，需要对细胞进行计数并调整细胞悬液密度，确保实验组间样本的一致性。

2.荧光标记：利用易于检测的标记直接标记细胞，以区分不同细胞便于后续分析分选，目前利用不同光谱性质的荧光团标记不同细胞是最常见和最成熟的技术，荧光标记主要包括荧光标记偶联抗体、细胞示踪染料、荧光蛋白。

3.流式细胞仪设置：根据标记物的特性，设置流式细胞仪的参数，包括激光波长、滤光片设置等，确保仪器正常工作并准备好进行检测分析。

4.样本分析：将标记后的细胞上样，仪器通过激光照射检测细胞荧光信号，根据标记物的特异性，可以识别和分析不同类型的细胞。

5.设定分选参数：根据实验需要，设置流式细胞仪的分选参数，包括调整补偿、设定筛选门、分选速度等，确保分选的准确性和有效性。

6.分选收集：根据设定的分选参数，进行细胞的有选择性收集和分选，可以将目标细胞单独收集或排除非目标细胞。

7.分选后处理：对分选后的细胞进行镜检观察细胞状态，对其进一步处理和分析，确保所得到的细胞符合实验要求后，进行下一步实验。