细胞增殖（Cell Proliferation）是指细胞在周期调控因子的作用下，通过DNA复制、RNA转录和蛋白质合成等复杂反应而进行分裂的系列过程。细胞增殖是生物体的重要生命特征，细胞以分裂的方式进行增殖，也是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础。细胞增殖能力的检测是评估细胞活性、基因毒性和抗肿瘤药物效果等的最常见方法。

CCK-8增殖检测

1.在96孔板中接种细胞悬液(100 μl/孔)，转入培养箱中预培养24小时；

2.向培养板加入不同浓度的待测药物；

3.将培养板在培养箱孵育一段适当的时间；

4.向每孔加入10 μl的CCK-8溶液(注意不要产生气泡)；

5.将培养板置于培养箱内孵育0.5-4小时；

6.用酶标仪测定450 nm处的吸光度。

根据标准曲线或参照对照组，计算出细胞的相对存活率或增殖指数。OD值越高，表明细胞活性或数量越强。

MTT增殖检测

1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，每孔180 μL，3000-10000个细胞/孔。

2.置37℃、5% CO2温箱培养使细胞贴壁，培养6-24 h。

3.加入适当浓度的受试化合物，继续培养适当时间。

4.小心吸去上清，加入90 μL新鲜培养液，再加入10 μL MTT溶液，培养4 h

5.然后吸掉上清，每孔加入110 μL Formazan溶解液，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分 溶解。在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值。

6.同时设置调零孔（培养基、MTT、Formazan溶解液），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、Formazan溶解液），每组设定3复孔。

根据标准曲线或参照对照组，计算出细胞的相对存活率或增殖指数。OD值越高，表明细胞活性或数量越强。

CFSE检测增殖

1.离心收集细胞，用1×细胞标记液悬浮细胞并调整密度至1-5×10 6个/ml细胞，取1 ml细胞置于15 ml离心管内。

2.取1 ml 37 ℃预热的 CFDA,SE 工作液加入到上述15 ml离心管内，轻轻混匀。

3.37 ℃避光孵育10 min。

4.立即在15 ml离心管内加入约10 ml 37 ℃预热的完全细胞培养液(含10% FBS)，室温颠倒数下混匀，以终止标记反应。

5.室温1000 rpm离心5 min去除上清，再用5-10 ml完全细胞培养液洗涤一次。

6.再加入5-10 ml完全细胞培养液，37 ℃孵育10 min，以促进CFSE在细胞内的驻留及未反应的 CFDA,SE进入完全细胞培养液。离心去上清，完成最后一次洗涤。

7.此时标记好的细胞已可进行后续的体外增殖检测或者特定目的的细胞示踪。调整细胞密度按照正常方法培养细胞，并在合适的时间点用荧光显微镜（488 nm激发光）或流式细胞仪FL1通道进行结果分析，呈绿色荧光。标记的细胞也可用于活体动物的移植，并用荧光进行示踪。（若需要对细胞进行固定，请用醛类固定剂如4%多聚甲醛于室温固定15 min）。

细胞克隆形成实验

1.从细胞处于对数生长期状态开始，通过胰酶消化将细胞完全悬浮于完全培养基中，并进行准确计数；

2.在每个实验组中，控制细胞数量在400-1,000个细胞/孔的范围内（对于不同的细胞类型，需要进行预实验以确定最佳细胞数量），并接种于6孔板；

3.持续培养至14天，或直到大多数单个克隆中的细胞数超过50个。在培养过程中，每隔3天更换培养基，并观察细胞状态；

4.克隆形成完成后，使用1 mL 4%多聚甲醛进行细胞固定，固定时间为15-30分钟。最后，用PBS洗涤；

5.向每个孔中加入1 mL结晶紫染液，染色时间控制在10-20分钟内；

6.利用PBS进行多次细胞洗涤，进行拍照（分别对整个六孔板及每个孔进行单独拍照）。